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菲罗门与ACE色谱柱的保养方法
点击次数:166 发布时间:2019-06-05

菲罗门与ACE色谱柱的保养方法

色谱柱是一种消耗品,因此使用寿命有限。

对于大多数应用,色谱柱应持续进行500-2000次注射(进样),但这会因样品的清洁度、流动相的pH值和保护柱卡套的使用(是否使用保护柱)而不同。

这里列出的做法有助于最大限度地提高硅基(硅胶基质)色谱柱的使用寿命。

 

一、色谱柱的平衡:当从一个流动相更换为另一个流动相时,或者在回收梯度(梯度循环)时,应需要10-20个柱体积。

下表显示了各种色谱柱尺寸(规格)的色谱柱体积。

如果溶剂的变化不太剧烈(例如80%至20%的ACN/水与ACN至THF(与之相对的由ACN至THF)),则需要的体积较少。

检查平衡最简单方法是进行两次样品注射。

如果保留相同,则色谱柱充分平衡;如果保留变化,应增加平衡体积并重新试验。平衡与溶剂的体积有关,与时间无关。

所以较高的流量(流速)可以减少平衡时间。

 

                                        近似的色谱柱容量(mL)

色谱柱直径

柱长度

50 mm

150 mm

250 mm

2.1 mm

0.1

0.3

0.5

3.2 mm

0.3

0.7

1.2

4.6 mm

0.5

1.5

2.5

10.0 mm

2.4

7.1

11.8

21.2 mm

11.6

34.7

57.8

 

 

 

 

 

 

 

二、色谱柱冲洗是一个简单的过程,可以通过清洗色谱柱中的顽固(保留较强的)物质来延长色谱柱的寿命。

每天结束色谱柱的使用时,应除去一切缓冲液(应除去色谱柱中的缓冲盐),然后用100%强溶剂(通常为ACN或MeOH,采用反相方法)冲洗色谱柱。

下一页列出的详细冲洗程序可以有效恢复色谱柱的性能,但应牢记:色谱柱是一种消耗品,因此请勿期望它能够永远的持续使用!

避免用100%的水冲洗反相色谱柱(嵌入极性基团或“AQ”色谱柱除外),因为相(固定相)去湿会影响清洗效果,而且流动相色谱柱的重新平衡会非常缓慢。

对于您的色谱柱,请按照以下所述的一般步骤,使用特定溶剂进行色谱柱冲洗。

应在冲洗之前查看制造商的建议(生产商说明书),以免损坏色谱柱。
1. 拆掉并翻转色谱柱(拆下色谱并反接)
2. 将色谱柱连接到泵上,而非检测器(不接检测器)
3. 用10-20个柱体积的溶剂进行冲洗,且流速不得高于QC色谱图的流速
4. 如果改变以下步骤,应确保在每个连续步骤中使用可混溶溶剂(溶剂可互溶)

 

反相色谱柱(C18,C8,C4,苯基,CN,'AQ'型)
a. 流动相无缓冲液
b. MeOH或ACN

如果金属离子被认为是污染的致因,应使用0.05M EDTA水溶液冲洗,然后用水冲洗,并按上述顺序冲洗。使用离子对试剂的色谱柱应专门用于离子对的应用之中。

 

未键合的硅胶柱(SIL)
a. IPA
b. MeOH
c. 乙酸乙酯

 

键合正相柱(CN、NH 2、二醇)
a. 三氯甲烷
b. IPA
c. 二氯甲烷
d. 己烷

 

阴离子交换柱(SAX,WAX)
a. 水
b. 甲醇
c. 三氯甲烷
d. 甲醇
e. 水

 

阳离子交换柱(SCX,WCX)
a. 水(冲洗时注入4x200L的DMSO)
b. THF

 

蛋白质的体积排阻柱
对于弱保留的蛋白质
a. 0.1M磷酸盐缓冲液,pH为3
对于强保留的蛋白质
a. 100%水至100%ACN的梯度,运行60分钟

 

三、色谱柱的合理存放有助于延长柱的使用寿命。

最简单的存放步骤为:从柱中除去一切缓冲液,然后用10-20个柱体积的强流动相溶剂(例如用于反相的MeOH或ACN)清洗柱,以除去柱中的顽固(强保留)物质。

然后用制造商指定的存储流动相,以10-20个柱体积的容量冲洗色谱柱(该信息应随色谱柱提供,并在QC检测色谱图中进行详细的说明)。

最后,安全地盖上柱帽(拧紧堵头),以防流动相蒸发。
除了色谱柱制造商明确建议的特定情况(例如一些离子交换柱)外,请勿使用缓冲液或者少于约25%的有机溶剂来用于储色谱柱存储,因为它们会导致微生物的滋生。(保存色谱柱,以防微生物的滋生)

 

• 每个新项目应使用一种全新的B型高纯度硅胶柱,并与最高质量的HPLC级试剂结合使用。
• 定期冲洗HPLC系统,去除盐和缓冲液,并定期保养系统,从而最大限度地减少止回阀(单向阀)和泵密封(密封圈)问题。

样本清理过程越彻底,样本就越干净;同时,与样本相关的问题发生概率就越小。

• 完成一系列(系统多次)运行(或在某些情况下,每次运行后)后,应使用强溶剂冲洗,这样有助于除去柱中的顽固残留(吸附较强的)物质,并将未来运行中的干扰降至最低(尽量减少对以后的测试的干扰),延长色谱柱的使用寿命。
色谱柱不能永远使用,但良好维护可减少不必要的更换支出

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