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HPLC故障排除3 - 鬼峰的出现及解决
点击次数:196 发布时间:2019-06-04

3.鬼峰问题

 鬼峰问题

 预防措施和解决方案

 鬼峰

柱或注射器被污染 (色谱柱或进样器污染)

仅使用HPLC级溶剂 

冲洗柱,以去除杂质 

在注射器用于下一个分析物时,应先进行冲洗

前一个注射导致的迟洗脱峰(前一次进样的后洗脱峰)  

延长运行时间

每次运行结束时用强流动相冲洗色谱柱

对于梯度运行,应以较高浓度结束(有机相比例结束梯度)  

RP HPLC中,水被污染1. 使用HPLC级水
样本中的未知(未知杂质)干扰1. 使用样品清理(净化措施)(例如SPE 

 负峰

溶质折射率低于流动相(RI检测器)  

使用折射率较低的流动相 

调换检测器极性以获得正峰值 

溶质的吸收低于流动相的吸收(溶质的紫外吸收低于流动相的紫外吸收)(UV检测器)

更改UV波长 

使用UV吸收较低的流动相

样品溶剂和流动相的成分不同

1. 如可能,更换样品溶剂并将样品溶解在流动相(更换样品溶剂,如有可能,使用流动相溶解样品) 

 峰值(毛刺)

流动相中存在气泡

对流动相脱气 

在检测器出口端,安装背压限制器。 

确保所有配件安装紧固

柱储存时未使用端帽 (堵头)

柱储存时应使用端帽 

用脱气的甲醇冲洗RP 

 
 

3.1.等度分离中出现的意外宽峰是因前次运行产生的峰洗脱延迟(在等度分离中,前次运行中的迟洗脱组分以宽峰的形式意外出现)。

对于等度分离,保留时间越长,峰应(色谱峰)越宽;但色谱图狭窄区域内的所有峰应具有大致相同的峰宽。如图11(箭头)所示,当窄峰中出现宽峰时,可能是因为之前注射(前次进样)的化合物发生了洗脱延迟。这很容易检查。

只需进行正常注射(进样),但将运行时间延长两到三倍。如果在正常运行时间结束后出现峰值(出峰),那就是因洗脱延迟导致的。

可以通过延长正常运行时间,以涵盖此峰的洗脱(洗脱时间将峰洗脱出来);也可以在每次运行结束时加入强溶剂冲洗液,以(来)清洗柱中的顽固物质。

图11.峰延迟洗脱通常在38.5分钟时出现(迟洗脱峰(正常情况下在第38.5分钟出现的洗脱峰)),位于(出现在了)下一个缩短的等度运行的色谱图的12.0分钟(箭头)处。来源[6]。

 

3.2.通过运行非注射(无进样)空白梯度并观察基线,可以分离梯度运行中的鬼峰

如图12a所示,当空白梯度出现过多的峰时,试剂污染可能是导致此问题的原因之一(可能是溶剂污染所致)。

在这种情况下,图12a显示运行过程中的峰值(峰)非常小(1-3 mAU),并且在0.8-1.0 AU范围内的主要成分分析中几乎没有峰值(对0.8-1.0 AU大小的主要成分检测峰没有影响);但是对于稳定性(性指标检测)或杂质的测定,1-2 mAU范围内的峰值应需要量化(也需要定量)。

在这种情况下,则需要进一步的研究。

在梯度运行之间的平衡期间,流动相中的非极性杂质一般沉积(聚集)在柱的顶部位置。然后,在梯度过程中,像其它峰一样,这些杂质被洗脱出来。

通过将平衡时间延长至三倍,检查问题的根源。如果空白梯度中的峰值(峰)增加约三倍,则水状溶剂最有可能是问题的致因(则极可能是水溶液中的杂质所致)。

如图12b所示,可将水和/或添加剂换成纯度较高的成分,以解决这一问题。

图12. 运行空白梯度:(a)A容器受到污染的水(A容器中溶剂有杂质)和(b)A容器中纯度较高的水。色谱柱:150x4.6mm C18;1.5mL/min;35℃;在255 nm处进行UV检测。梯度:0-83%ACN /水运行13分钟,并保持5分钟。来源[7]。

 

3.3.等度或梯度运行的负峰不如正峰常见(相对于正峰较为少见),但也会发生。

负峰在离子对或其它方法中更为常见,其中流动相试剂在选定的检测波长下具有显著的紫外线吸光度(倒峰在有离子对或流动相在检测波段下有明显紫外吸收的情况下更为常见)。

在这种情况下,背景吸光度将极为重要(背景吸收可能较显著)(可能为0.5 AU或更多),但不会被注意到(较难觉察),因为系统在每次运行开始时会自动调节至零点,并检测信号。

如果化合物的吸光度低于流动相背景(背景吸光度),其会显示为负峰。

致因的确认和峰的消除方式与正峰相同(确认问题来源并消除倒峰的方法与正峰相同):检查水、试剂或样品的制备过程。

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