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HPLC故障排除2 - 保留时间问题
点击次数:124 发布时间:2019-05-30

2.保留时间问题

 

 

可能致因

预防措施/解决方案

减少保留时间

键合固定相的损失 (流失)

  1. 更换柱 (更换色谱柱)

  2. 在pH值为2-8的硅基(硅胶基质)RP柱上操作

固定相上的(存在)活性基团

  1. 在流动相中使用有机改性剂

  2. 增加缓冲强度 (增加缓冲液离子强度)

增加流量 (流速)

  1. 检查并调整泵的流量(流速)

柱超载 (色谱柱过载)

  1. 减少注入的样本量 (减小进样量)

  2. 使用具有更大内径的柱 (se谱柱)

延长保留时间

改变流动相的成分

  1. 覆盖溶剂容器(盖紧溶剂瓶)

  2. 制备新的流动相

键合固定相的损失 (流失)

  1. 更换柱 (更换色谱柱)

减少流量 (流速)

  1. 检查并调整泵的流量(流速)

  2. 检查系统是否存在泄漏,包括泵的密封 (泵密封圈)

流动相中存在气泡

  1. 检查流量和压力

  2. 对流动相脱气(流动相脱气)

波动保留时间

柱平衡(色谱柱平衡时间)不足

  1. 在运行之间(在两次进样之间用更长时间)

  2. 充分平衡柱

  3. 用浓缩样品调整色谱柱

流动相成分的变化

  1. 检查流动相的成分,必要时补充新的成分(新配流动相)

  2. 检查比例阀的准确度

缓冲能力不足

  1. 使用> 20mM的缓冲液浓度

波动柱的温度 (柱温波动)

  1. 稳定的(稳定)室温

  2. 保持柱恒温

 

 

2. 保留变量(时间变动)

如果所有峰(色谱峰)的保留时间均发生了变化,其致因很可能是如下因素发生了变化:流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速。

如果等度或梯度流动相在在线式混合中出现错误,也可能导致保留时间出现问题。

下面将简要介绍这些问题来源(对上述每个原因都简述如下)。

 

2.1.如果操作人员操作不当,则会导致流动相组成的意外变化,例如使用在线式混合系统时,流动相混合物(系统)设置不正确;或替换新批次流动相时,未妥善制备新的流动相(新流动相配制不正确)。

在极少数情况下,会出现流动相组分选择性损失的情况,例如蒸发。

当流动相发生变化时,峰形(色谱峰)通常会向相同的方向移动,以缩短或延长保留时间(保留时间变长或变短);而相对保留(选择性因子,a)通常会发生变化。

检查流动相组成错误的蕞佳方法是仔细检查(复查)系统设置;如有必要,应制备新的流动相。

方法文件应包含特定流动相变化影响的相关信息。例如,有机溶剂或pH值的微小变化会对色谱图产生特征(在色谱图体现出特征性的)影响,如分辨率或保留的变化(分离度的变化或保留时间的漂移)。

如果您怀疑设备出现故障,请将色谱柱和流动相移至另一个HPLC系统,然后再次运行。

如果问题依然存在,则问题在于流动相或色谱柱;如果问题不再出现,则可能与其他系统组件或参数相关。

 

2.2.色谱柱化学(化学性质)变化会在色谱柱的整个生命周期内出现,并且一般会在数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化(漂移)(更长或更短)以及更多的峰拖尾。

更换新柱以确定是否是柱老化导致的问题(可确证色谱柱老化)。

500-2000次注射(进样)的柱寿命是较为理想的;在这一点上,柱成本相较于整体分析,是十分微小的,所以更换新柱的可行性较高(色谱柱在整个分析的成本中所占比例低,因而可以合理更换色谱柱)。

如果色谱柱的使用寿命过短,应仔细检查操作条件,以确保它们适用于该色谱柱。

图5显示了在极端操作条件下,色谱柱寿命较短的示例(缩短的寿命)。

 

2.3.色谱柱温度变化会导致保留时间的变化:每1°C的温度变化会引起1-3%的保留时间变化。如果不使用柱温箱(即“室温”条件),由于实验室温度的变化,温度通常会在日间(和夜间)循环(周期性)变化。

虽然在室内恒温器的测量下,实验室温度显示为恒定,但是HPLC系统的微观(微)环境可能会发生显著变化,尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时,温度变化极为明显。

使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题,且HPLC系统应远离通风口放置。

 

2.4.流量(流速)问题可能是因存在气泡、泄漏或泵问题(故障)导致的。
气泡问题应和低压(或脉动压力)以及保留时间的增加相关(可能伴有柱压过低或柱压波动,且保留时间延长)。

对于双头泵,如果只有一个泵头存在气泡,则流量和压力可能会发生脉动(跳动)。

应对流动相进行脱气,然后打开放气阀清空泵,并向泵中多次加入5-10mL的流动相,以正常流速流经泵,从而排出气泡(打开排气阀以正常流速的几倍泵入5-10ml流动相经过泵,以排出气泡)。

在某些情况下,可能需要使用低粘度的脱气溶剂,如甲醇(MeOH)或乙腈(ACN)来清除泵中顽固的气泡。

泄漏也会延长保留时间。配件(接头)上的滴水配件或玻璃体内的结晶沉淀都是泄漏的证据(查看接头如有液滴或结晶析出,可证明有泄露)。

请特别注意色谱柱上游的配件(之前的接头)。

自动进样器内的配件和密封件(接头和密封圈)可能难以检测,可借助手电筒和小镜子进行检查。

如果使用不锈钢配件,通常1/4的紧固螺母(将接头螺好再拧紧1/4圈)便可以阻止泄漏。

使用PEEK配件(接头)时,应停止泵,松开接头,将管子推到配件(接口)端口的底部,然后在重新启动泵之前拧紧配件(接头)。

拧紧PEEK配件(接头)时如果存在流动的液体,会导致管道在配件中滑动,产生柱外死体积,进而影响分离效果。

存在缺陷的止回阀(单向阀)或磨损的泵密封件(圈)会导致流量偏低或波动。

止回阀(单向阀)出现问题将导致压力的波动。如果在清除泵中气泡后还无法改善压力波动的情况,则止回阀(单向阀)可能存在故障。

可以更换新的止回阀(单向阀);也可以将止回阀(单向阀)放置在(装有)MeOH的烧杯中,对其进行超声处理,以实现有效的清洁。

如果无法有效区分入口端和出口端之间的止回阀(如不易分清入口单向阀和出口单向阀),请划线标记或用标签标记烧杯。将每个止回阀(单向阀)放入单独的烧杯中进行清洁,使其分开清洁。如果部件滑出,应小心组装,以免受到污染(无尘手套,避免划伤部件等)。

随着使用时间的增加,泵密封件(圈)会出现磨损;而且使用缓冲流动相或将其置于高盐条件下(例如离子交换法),会缩短它的使用寿命。

您可以建立一个预防性维护计划,定期更换密封件并做相应记录(准确记录更换密封圈的时间间隔,就可以建立预防性的维护计划),从而在故障发生前更换密封件。如果无其它指标(征兆),应至少每年更换一次密封件(圈)。

 

2.5.比例阀和在线混合发生故障会降低梯度洗脱的效果(使梯度洗脱效果变差)。

图6示例显示了两次连续注射肽样品的梯度洗脱分析。在这种情况下,系统适用性测试允许两次运行之间存在0.1分钟的变化(保留时间变化);第一个峰值不符合该标准,最后一个峰值勉强通过而中间两个峰值明显超出规定值。

图6. 两个连续梯度运行的(两次连续梯度洗脱)色谱图显示了梯度中点附近的峰形具有较大的误差(保留时间的误差较大)(13分钟)。来源[3]。

 

下面介绍了一种检查流动相配比(混合)精度的简单方法。

将柱更换为0.005英寸直径约1米长(0.12mm)的管道(取下色谱柱,换上长约1米,内径0.005英寸(0.12mm)的管路),在A容器中加水,且B容器中放有含有0.1%丙酮的水,将检测器波长设置为265nm,并使用足够高的流速使止回阀(单向阀)能够有效工作(例如2mL/min)。

以10%为增量运行一系列梯级(梯级实验)(10%、20%、30%……90%、100%B)。

由于问题经常出现在50%B附近,所以在45%B和55%B处增添了额外的梯级。

其结果应是平滑的阶梯状(参见图8a)。

对于图6的样品,在40%-60%B的梯级中观察到图7的曲线。

梯级是扭曲的(已变形),且45%到50%B的梯级(梯级变化)是8.4%而不是5%。

图7中的虚线近似于(拟合了该)梯度,同时(在)45%和50%B之间存在偏移。

因此,此处应是由具有较大保留变量的峰被洗脱导致的(不幸的是,这正是那些保留时间偏差较大的峰出峰的位置)。

HPLC系统可对比例阀进行调节。

当执行此操作时,梯级会变得平滑且保留时间也会处于规格范围之内。

图7. 在图6的梯度中点附近执行配比(比例)阶梯测试的结果。理论值显示在括号内。来源[3]。

 

如果系统性能良好,其阶梯测试的结果应与图8a类似,在整个图中呈现阶梯状。

未注射的0-100%B梯度是应运行的对比测试(另需同时进行一无进样的0-100%B梯度试验)。

它应显示为线性基线、线性梯度部分和线性后期梯度保持,每个部分之间均是平滑的曲线过渡(线性梯度部分以及一段梯度升高后维持直线,每两段之间为平滑曲线过度)。

图9的示例显示了在约25%、50%和75%B的线性(箭头)条件下,空白梯度运行呈现有规律的偏移。

图8. 图9显示了HPLC系统的梯度阶梯测试结果。(a)0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100%B的梯级;(b)以1%的梯级向上跟踪至45-55%。箭头显示了50和51%之间的“较短”梯级。来源[4]。

 

与这些条件相对应的阶梯测试如图8a所示,并且在这个度量(放大比例)下表现良好。

为了更仔细地检查问题区域,在45-55%B范围内以1%的增量进行阶梯测试,如图8b所示。

这个扩展(放大)图清楚地显示了在50%和51%之间的梯级中,存在不规则性。

在线性图中的定期(有规律间隔的)误差(图9)表明,控制比例阀的算法或比例阀本身存在问题。

在目前的情况下,调整控制(控制软件)软件无法解决问题,因此应更换比例阀,以解决问题(因此更换了比例阀,问题被解决)。

图9. 故障比例阀线性梯度图。箭头显示线性偏离;绘制下面的虚线以供参考(虚线为标准参考线)。以1mL/min的速度运行梯度0-100%B 15分钟;A =水、B = 0.1%丙酮水溶液;检测UV 265nm。来源[4]。

 

尽管可以假设单一来源是导致特定HPLC问题的原因(虽然通常可以假定某HPLC问题只有一个故障原因),但情况并非总是如此。

图10a显示了以非常浅的梯度(30分钟内19-24%ACN)连续三次注射肽样品的结果(显示了一种多肽样品三次连续进样,窄梯度洗脱(30分钟内19-24%乙腈梯度洗脱))。

由于怀疑存在流量(流速)问题,因此在双活塞双泵系统中更换了所有8个止回阀(单向阀)和4个泵密封件(圈)。

这大大改善了保留变量(保留时间大为改善),保留范围从2.1分钟变化到1.0分钟(图10b),但仍然是(此偏差仍)不可接受的。

为了进一步研究问题,将溶剂预混合到装有15% ACN的A容器和装有25%ACN的B容器中(在A瓶中预混合15% 乙腈,在B瓶中预混合25% 乙腈)。

当调整仪器设置以产生与图10a和b相同的梯度时,获得图10c所示的结果。尽管仪器的配比精度在±0.1%的规格范围内,但对于非常浅(窄)的梯度来说仍是不够的。

预混合溶剂将有效精度从0.1%提高至0.01%,如果该样品希望具有令人满意的保留时间再现性,这点是必需的。

预混合可以提高系统性能,以满足苛刻的分离要求。

图10.三次连续注射肽样品的扩充(放da)色谱图。产生的色谱图:(a)使用原始系统配置(b)更换所有止回阀(单向阀)和泵密封件(圈)后(c)使用预混流动相。色谱柱:250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃运行,并在215nm检测。梯度:30分钟内19-24%ACN / 0.1%TFA的水溶液。来源[5]。

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