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超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处介绍Ⅰ - 提高灵敏度
点击次数:139 发布时间:2019-05-22

ACE色谱柱超惰性固定相对生物分子反相HPLC的益处
提高灵敏度
将TFA(三fo乙酸)用作肽类和蛋白质反相分离的流动相添加剂。
该添加剂通常被用于改善肽类和蛋白质复杂混合物的峰形和分离度。

如下图所示,在流动相中使用0.1%TFA可以使填充有活性固定相的色谱柱产生与由超惰性固定相制备的新一代色谱柱相当的峰宽。

然而,随着TFA浓度降低至0.01%以及最终的0.005%,超惰性相上的峰宽保持不变,但活性固定相上的峰宽会发生变形。
使用极低水平TFA分析肽类和蛋白质的能力有利于采用质谱法进行高灵敏度检测。

TFA可与多肽形成复合物合并增强选择性。然而,该相同的复合作用会降低质谱仪的灵敏度。

 

用于肽类和蛋白质分析的ACE 300Å色谱柱

蛋白质
条件
色谱柱:ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速:1.0ml/min
温度:环境
流动相:A. 0.1% TFA(溶于水中) B. 0.1% TFA(溶于乙腈中),30分钟内 5%-70% B
检测:UV, 280nm

化合物
1. 核糖核酸酶A
2. 细胞色素C
3. 全铁转铁蛋白
4. 脱辅基肌红蛋白

 

肽类

条件
色谱柱:ACE 5 C18-300, 250 x 4.6mm
流速:1.0ml/min
温度:环境
流动相:A. 0.1% TFA(溶于水中)B. 0.1% TFA(溶于乙腈中),25分钟内10%-40% B
检测:UV, 220nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催产素
3. 血管紧张素II
4. 神经降压素

 

灵敏度和峰形,随TFA的浓度而变化

色谱柱:250 x 4.6mm, 5μm C18 300Å
流动相:A:TFA(溶于水中) B: 溶于乙腈中的TFA(按照上述说明为%TFA),37.5分钟内10%-55%B。
流速:1.5mL/min
检测:UV 200nm

化合物
1. 甘氨酸-酪氨酸
2. 催产素
3. 血管紧张素II
4. 神经降压素

ACE 5 C18-300超惰性硅胶

Vydac 218TP低纯度“活性”硅胶

随着TFA浓度的降低,低纯度硅胶色谱柱(右图)显示性能急剧下降。
由超惰性硅胶制成的色谱柱(如ACE)会在TFA浓度降低时保持性能。

备注:比较性分离物不代表所有应用。

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